易基因｜文献科普：DNA甲基化测序揭示DNMT3a在调控T细胞同种异体反应中的关键作用

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2022年7月1日，美国约翰霍普金斯大学西德尼基梅尔综合癌症中心Christopher J. Gamper 和 Kenneth R. Cooke团队以“Donor T cell DNMT3a regulates alloreactivity in mouse models of hematopoietic stem cell transplantation”为题在《J Clin Invest》杂志发表研究文章，通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）揭示了供体T细胞DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)调节造血干细胞移植小鼠模型的同种异体反应性中的关键作用。

标题：Donor T cell DNMT3a regulates alloreactivity in mouse models of hematopoietic stem cell transplantation（供体T细胞DNMT3a调节造血干细胞移植小鼠模型的同种异体反应性）

时间：2022.07.01

期刊：The Journal of Clinical Investigation（J Clin Invest）

影响因子：IF 19.456

技术平台：WGBS、RNA-seq

样本：分别接受来自同基因（Syn）、同种异体WT（Allo-WT）和Dnmt3a基因敲除型（Allo-KO）供体BMT实验的雌性小鼠

实验：同种异体血液或骨髓移植 (BMT)实验、急性移植物抗宿主病(aGVHD)评估、移植物抗白血病(GVL)实验、T细胞迁移实验、MLR检测、WGBS测序分析、RNA-seq测序分析

摘要：

同种异体血液或骨髓移植（allo-BMT）是许多恶性和非恶性疾病的唯一治疗方法，然而是否成功受到移植物抗宿主病（GVHD）和恶性复发的条件限制。在不影响移植物抗肿瘤（GVT）活性的情况下有效缓解GVHD方法仍不清楚。

DNA甲基转移酶3a（DNMT3a）是稳定活性T细胞反应的表观遗传机制重要组成部分。作者提出假设，供体T细胞DNMT3a在同种异体血液或骨髓移植（allo-BMT）后调节同种异体反应性，将T细胞Dnmt3a敲除（KO）小鼠用作allo-BMT模型的供体。研究结果发现，接受Dnmt3a-KO供体的allo-BMT小鼠出现严重急性移植物抗宿主病（aGVHD），炎症细胞因子水平和器官组织病理学评分增加。KO小鼠T细胞在次级淋巴器官中迁移和增殖较早，并显示出向小肠转运的优势。BMT后纯化的供体T细胞群用于全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和RNA-seq测序分析，结果显示KO小鼠T细胞具有与WT细胞相似的整体甲基化水平，但部分区域出现明显的低甲基化。使用高度敏感的计算方法生成了变化后的表观基因组全图谱，DNA低甲基化与T细胞信号和分化通路基因表达变化相对应。此外，Dnmt3a-KO小鼠T细胞具有优异的移植物抗肿瘤（GVT）活性。研究结果证明了DNMT3a在调节T细胞同种异体反应性中的关键作用，并揭示了调控T细胞的耐受通路。这些结果也为解读将供体DNMT3a突变与GVHD增加、复发率降低和生存率提高相关联的临床数据提供平台。

实验方法和流程设计

研究结果

（1）Dnmt3a-KO小鼠供体T细胞在免疫表型上与同窝WT对照组没有区别

生殖细胞Dnmt3a丢失导致4周龄细胞死亡，产生T细胞Dnmt3a-KO小鼠。T细胞特异性KO小鼠后代健康，体型正常。从KO小鼠和WT同窝小鼠收集脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓（BM）。在细胞结构、CD4+和CD8+分布或脾脏Treg数量方面未观察到组间差异。在平行实验中，利用从B6D2F1（F1）小鼠分离的脾树突细胞（DC）对纯化的KO和WT（C57BL/6J(B6)）小鼠T细胞进行体外刺激。组间未观察到增殖、细胞溶解活性或细胞因子产生（数据未显示）差异。

（2）供体T细胞Dnmt3a丢失会加速aGVHD严重程度

为确定供体T细胞Dnmt3a基因缺失对同种异体反应性的影响，作者使用已建立的单倍体模型 B6（H-2b）和F1（H-2bxd）小鼠分别作为BMT供体和受体。从生存率和临床评分来看，与接受来自WT供体的allo-BMT小鼠相比，B6 Dnmt3a-KO供体的小鼠表现出更严重的全身性aGVHD。而同基因BMT受体没有发生GVHD，且最终与非移植对照无法区分。仅接受T细胞耗竭的WT或KO BM的小鼠也不会发生GVHD。与同种异体对照相比，Dnmt3a- KO供体进行BMT后观察到严重的全身性GVHD与肠道（小肠和大肠）和肝脏的组织病理学评分增加相关。在BMT后第7天，发现KO受体血清中的促炎细胞因子（包括IFN-γ，TNF-α，GM-CSF，IL-17，IL-3和IL-10）显著增加，且KO受体表现出强大的BM植入和供体来源的造血功能。为确保不是应变依赖现象，在MHC系统（B6→BALB/cJ）模型中进行了类似的BMT实验，验证了与WT对照供体相比，DNMT3a-KO的GVHD严重程度显著增加。

图1：DNMT3a丢失型T细胞导致实验性aGVHD加速

致命性受体接受来自同基因（Syn），同种异体WT（Allo-WT）或Dnmt3a-KO（Allo-KO）供体的BMT实验。单倍体模型B6→F1：

（A）总生存期

（B）临床GVHD评分

（C）无T细胞和仅T细胞耗竭BM的生存期。每组3个重复，Syn n=15，Allo n=28。

（D）第7天组织病理学器官特异性GVHD评分；每组n=4-5。

（E）多重珠测定第7天的血清细胞因子水平。每组3个重复，Syn n=8，Allo n=17。

（F）第14天的BM细胞、T细胞嵌合和外周血计数；每组n=4-5。

（G）B6→BALB/cJ模型，从左到右：生存率，临床GVHD评分，体重减轻。每组2个重复，Syn n=10，Allo n=20。

（3）没有供体T细胞Dnmt3a基因表达的aGVHD加速主要由CD8+细胞驱动

图2：CD8+ T细胞中的DNMT3a丢失导致GVHD增加

（A-C）混合实验中的生存率，WT和KO 中的CD4+和CD8+ T细胞分别分离并以2:1的CD4/CD8比例以各种组合共注射。每组2个重复，Syn/WT/KO 各n=8，混合组n=16。

（D） B6→Bm1模型中的生存率，供体和受体仅在MHC I有所不同，移植物仅含CD8+ T细胞。每组2个重复，Syn n=9，Allo n=16。

（E） B6→Bm1模型在第7天的组织病理学器官特异性GVHD评分，每组n=5。

（F） B6→Bm12模型在TBI剂量为11Gy的生存率，供体和受体仅在MHC I有所不同，移植物仅含CD4+ T细胞。每组2个重复，syn n=10，allo n=19。

（G） B6→Bm12模型，TBI剂量为9Gy的生存率和临床GVHD评分。所有三组都保持100%生存率。

（H） 组织病理学GVHD评分。每组2个重复，Syn n=9，Allo n=14

（4）CD4+ CD8+双阳性T细胞群出现在Dnmt3a-KO T细胞受体中

B6→F1模型的平行实验，小鼠在第7天和第14天被处死。通过多色流式细胞术分析脾脏和淋巴结的单细胞悬液，鉴定出一个明显的CD4+ CD8+双阳性（DP）细胞群。该细胞群在Dnmt3a-KO T细胞的受体中显著扩增。

图3：GVHD增加与Dnmt3a-KO T细胞受体CD4+CD8+双阳（DP）T细胞群出现有关

脾组织T细胞CD4与CD8的流式细胞术显示B6→F1模型（A）和B6→Bm1（B）模型在第7天DP细胞群显著扩增。（TCD, T cell–depleted）

（5）Dnmt3a基因表达的损害增强了allo-BMT后早期T细胞增殖和向次级淋巴器官和胃肠道迁移

图4：DNMT3a表达丢失导致供体T细胞向SLOs转运

纯化的WT和KO B6 T细胞分别用CSFE和e450染色（重复实验中一致），并以1:1比例（3×106-5×106个细胞）共同移植至到同种异体F1受体小鼠中。24和48小时后进行脾（A）和淋巴结（未显示）流式细胞术。每组2个重复；每组每个时间点n=6。

（B） 第4天通过CD45.1/2和CD90.1/2之间的等位基因差异区分WT和KO群。每组2个重复，每组n=8（除MLN n=5）。

（C） 通过多重珠测定（multiplex bead assay）在B6→F1模型中检测血清趋化因子水平。每组3个重复，Syn n=8，Allo n=17。

（6）Dnmt3a丢失导致部分区域出现基因组低甲基化

图5：DNMT3a丢失导致部分区域基因组低甲基化

B6→F1模型第10天通过流式细胞术分离WT和KO小鼠的脾CD4+、CD8+和CD4+CD8+ T细胞，提取DNA和RNA进行WGBS和RNA-seq测序分析。

（A） MML在所有纯化子富集的相似分布。

（B） 染色质状态和基因调控功能注释的KO和WT CD8+T细胞基因组特征比较的JSD箱形图

（C-D） 小鼠基因图谱（C）和KEGG 2021人类数据库（D）对实验组之间差异甲基化基因富集通路的EnrichR分析。SP,单阳性。

（E） Ccr9基因启动子DNMT3a WT和KO CD8+ T细胞之间的差异甲基化区域示例，JSD峰（peak）表示差异甲基化，dMML负峰表示KO细胞低甲基化。

（7）差异甲基化区域对应基因转录的变化

图6：差异甲基化区域与基因转录变化相关

（A） RNA-seq样品的全转录组PCA；每组n=4。

（B） KO与WT CD4+ T细胞差异表达转录本火山图（log10 P值与log2倍表达变化）。Sig,意义。

（C） KO与WT CD8+ T细胞中差异表达转录本火山图。

（D） T细胞群之间排名靠前的差异表达基因的热图聚类。每列代表一个重复。

（E） MSigDB C7数据库KO和WT CD8+ T细胞过表达的免疫相关基因代表性GSEA富集图。Adj,调整。

（8）甲基化组和转录组变化为GVHD增加提供机制线索

图7：甲基化组和转录组变化为增加GVHD严重程度提供了机制线索

（A） 图6D中的热图特写。

（B） 图4B CCR9在迁移实验中的流式细胞术表达。在第4天，脾脏中的大部分CCR9+细胞是WT，而开始向MLN、PP、IEL和LP迁移的细胞大部分是KO。每组2个重复，每组n=8（除MLN n=5）。

（C） CCR9的MFI。

（D） B6→F1模型中第 7天CD4+和CD8+细胞上的PD-1和TIM3表达（上：脾T细胞百分比；下：绝对数）。在LAG3表达中未检测到差异。每组2个重复；每组Syn n=8， Allo n=9。

表1：RNA-seq显示的Ccr9基因表达

表2：参与T细胞耗竭通路的基因表达

（9）Dnmt3a-KO T细胞具有优异的GVT效应

图8：DNMT3a-KO T细胞具有优异的GVT效应

B6→F1模型第0天将P815肿瘤细胞（每只小鼠500个细胞）添加到接种体中，通过BLI监测肿瘤负荷。（A） BLI图像。

（B） 肿瘤相关死亡。

（C）平均和个体肿瘤负荷，以每秒光子数表示。数据显示2个重复实验中的1个；每个实验组的Syn n=5，Allo n=10。

关于全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因0755-28317900。

参考文献：

Ktena YP, et al. Donor T cell DNMT3a regulates alloreactivity in mouse models of hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest. 2022 Jul 1;132(13) pii: 158047.

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